随着全球基因治疗市场的高速增长，腺相关病毒（AAV）因其能长期表达、毒性低、免疫原性低、组织特异性高等优势，已成为基因治疗领域最重要的基因载体之一。我们将围绕腺相关病毒（AAV）为大家带来AAV体内实验设计，动物注射方法及AAV效力检测方法等一系列干货十足的文章，下面跟随我们的脚步来了解腺相关病毒（AAV）吧。
01、AAV简介
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是目前发现结构最简单的、无包膜的单链DNA病毒，病毒基因组长约有4.7Kb，属于细小病毒家族。AAV自身不能复制，必须依赖于其它病毒复制，比如腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒，有超过80%的人携带AAV，未发现AAV与任何疾病相关。
重组腺相关病毒（Recombinant AAV，rAAV）是经工程改造的AAV载体，它剔除了AAV基因组全部编码蛋白Rep或Cap基因序列，只在两端保留作为包装信号的反式DNA序列（即ITR）。
02、AAV基因治疗
rAAV与慢病毒/逆转录病毒相比，rAAV感染细胞后不会与宿主基因组整合重组，从而避免产生癌症的风险。自1984年起，第一个rAAV载体被证明能转导外源基因进入哺乳动物细胞内，rAAV就作为传递基因的载体逐渐被应用于生命科学研究。根据Clinical Trials.gov上统计，目前有超过250多种AAV基因治疗临床项目在全球范围开展，迄今为止，美国FDA已批准了2个AAV基因治疗法：第一种为Luxturna，于2017年获得批准用于治疗莱伯氏先天性黑蒙症，这是一种遗传性视网膜疾病；第二种为Zolgensma，于2019年获得批准用于治疗小儿脊髓性肌萎缩症。
2022年7月20日，PTC治疗学公司宣布欧盟已批准Upstaza (eladocagene exuparvovec)，是目前为止，第三款AAV基因疗法药物，用于治疗年龄在18个月及以上、临床、分子和遗传学确诊为AADC缺乏症并伴有严重表型的患者。Upstaza是第一种直接注入大脑的基因疗法。越来越多的重组AAV载体的安全性和有效性已在多个Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中得到证实。
2022年8月24日，BioMarin宣布，欧盟批准Roctavian(Valoctocogene roxaparvovec) 基因疗法的有条件上市，用于治疗体内不含凝血因子VIII抑制物和腺相关病毒5（AAV5）抗体的重度A型血友病成人患者。Roctavian是首款治疗血友病A的获批基因疗法。此外，欧盟还保持了该疗法的孤儿药认定并授予其10年市场独占期。
目前的病毒载体类别繁多，AAV是基因治疗病毒载体中占比最大的，除此之外还有慢病毒、逆转录病毒以及腺病毒等，不同的病毒载体具有不同的生物学特征，这里列出一些它们的生物学特征以供参考，而AAV载体相比其他慢病毒载体具有一些非常显著的优势。
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03、AAV载体优势
高安全性和极低免疫原性
野生型AAV是天然缺陷型病毒，重组AAV不整合基因组，未发现与任何疾病相关，极低免疫原性。
感染宿主范围广
AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞。
高组织嗜性
AAV有百种血清型，能够特异性感染不同的组织或器官。
感染扩散能力强、特异性强
AAV体积小、滴度高的特点，在体内扩散能力强，并具有较高的组织特异性。
体内表达时间长
AAV滴度可至5E+13GC/ml，并可在体内长期稳定表达。
AAV基因疗法在过去几年里快速发展，并逐渐为大众所知，医学上各种罕见病和严重疾病都可以通过基因疗法提供临床诊疗方案。基因药物需要借助基因传递系统在体内传递，从而起到治疗效果，而AAV作为最有潜力的的基因传递系统之一，无疑为基因治疗插上腾飞的翅膀。
04、AAV基因组
目前大多数基因治疗用rAAV以AAV2基因组为骨架，基因组全长为4679bp，两端为145bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）, ITR序列之间为AAV病毒的编码区，含有两个开放阅读框（ORF），左侧ORF编码4种序列相互重叠的基因，分别编码Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等四种参与病毒基因复制的蛋白，右侧ORF编码3种Cap蛋白，分别是VP1、VP2、VP3三种组成病毒衣壳的蛋白，嵌入部分编码1种AAP蛋白。
AAV基因组结构
病毒基因组中三个启动子根据它们在基因组中所处的位置被命名为p5、p19、p40，其中p5、p19负责调控Rep蛋白的表达，p40负责调控Cap蛋白的表达，三个启动子合成的mRNA共用一个polyA位点。
ITR基因组结构
05、AAV生活周期与重组
腺相关病毒在感染细胞后，需要辅助病毒的帮助才能进入裂解期，辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。在没有辅助病毒的情况下，腺相关病毒基因的表达会受到限制，此时一部分腺相关病毒DNA会在ITR以及Rep蛋白的帮助下整合到人类19号染色体上，而对于研究中常用的重组AAV，由于其基因组不含Rep基因，因此将转导后AAV基因组以游离体的形式存在于细胞中，有助于转基因在细胞中的长期表达。
AAV生命周期
AAV重组示意图
06、下期预告
腺相关病毒（AAV）的基础干货，大家是否有收获呢？下期我们将推出进阶内容《AAV体内实验设计》，敬请期待。